ГЕМАТОЛОГИЯ

Реамберин – 1,5% – 400 мл – раствор для инфузий, выпускаемый НТФФ «Полисан», представляет собой изотоническую композицию соли янтарной кислоты (сукцинат натрия с хлоридами магния, калия и натрия), обладающую дезинтоксикационным, антиоксидантным эффек­тами при парентеральном введении. Присутствие в составе препарата ионов сукцината и магния создает предпосылки для реализации физи­ко-химических влияний на белок-белковые взаимодействия и сродство различных лигандов плазмы крови к транспортным молекулам. В силу этого некоторые важные в практическом отношении эффекты препара­та следует ожидать сразу после попадания его компонентов в кровь.

Цель исследования

Целью исследования являлось подтвердить наличие антиагрегант-ного действия препарата реамберин в крови in vitro у доноров. При выявлении обозначенного эффекта у препарата для выяснения меха­низмов развития антиагрегантного эффекта проводился анализ сосудисто-тромбоцитарного и плазменно-коагуляционного звеньев гемостаза в крови у доноров in vitro.

Методики исследования

Кровь для исследования забиралась у 22 доноров утром натощак пункционной иглой из локтевой вены самотеком. Свертываемость кро­ви предупреждалась 3,8% раствором цитрата натрия, добавляемого в соотношении 1 : 9. Для исключения контактной активации тромбо­цитов в работе исполь­зовалась пластмассовая или силиконовая посуда. Вначале кровь центрифугировали на малых оборотах (15 минут при 100 g). При этом определялась богатая тромбоцитами плазма, которая отсасывалась в пластмассовые пробирки. Затем оставшуюся кровь снова центрифугировали, но уже на более высоких оборотах (15 минут при 2000 g). Образовавшийся после повторного центрифугирования верхний слой являлся бестромбоцитарной плазмой. Плазма, богатая тромбоцитами, использовалась для исследования функциональной ак­тивности тромбоцитов, бестромбоцитарная плазма – для калибровки шкалы оптической плотности прибора и, при необходимости, для раз­ведения богатой тромбоцитами плазмы до стандартного содержания клеток, которое должно составлять (200-250) × 109/л.

Для исследования влияния реамберина на показатели свертывающей системы крови in vitro в 0,874 мл плазмы крови 22 доноров – основная серия опытов – добавлялось 0,026 мл раствора препарата или 0,026 мл физиологического раствора – контрольная серия опытов. Эти растворы инкубировались в течение 10 и 60 минут при температуре 37° C. После этого производился анализ показателей тромбоцитарного и плазменно-коагуляционного звеньев гемостаза. Исследование проводили с исполь­зованием агрегометра АР 2110 (Беларусь, Минск). Анализировались следующие показатели: число тромбоцитов, 109/л (в контрольной группе 222,9 ± 6,18), время достижения максимальной агрегации тромбоцитов, сек (в контрольной группе 7,14 ± 0,78), максимальная амплитуда (в кон­трольной группе 14,3 ± 1,8), скорость на 30 сек., %/мин (в контрольной группе 10,12 ± 0,98).

Диагностический комплекс агрегирующих агентов использовался для преимущественного выявления того или иного звена в цепи реак­ций, лежащих в основе агрегационного процесса: состояния соответс­твующих мембранных рецепторов (АДФ, адреналин), способности кровяных пластинок развивать реакции освобождения (АДФ, адрена­лин, коллаген). Исследование индукционной агрегации тромбоцитов проводилось на агрегометре АР 2110 с различными агрегирующими агентами: АДФ 5 мкМ («Технология-стандарт», Россия), адреналином 5 мкМ («Технология-стандарт», Россия), коллагеном 0,2 мг/л, адгезии – коллагеном 2 мг/л (СПбНИИ ГТ, Россия). Исследование по опре­делению активированного времени рекальцификации (АВР) (каоли­новое время) проводилось с помощью метода Bergerhof U.и [1954], протромбинового времени. Протромбиновый индекс (ПТИ), прово­дилось одностадийно по A. Quick [1966], фибриногена с помощью ме­тода Рутберга Р. А. [1961]. Тромбинового времени с помощью метода R. Marbet, Winterstein. [1959] (Детинкина Г. Н. и соавт., 1984). Индекс коагуляции (ИК) АВР вычислялся с помощью формулы:

 

ИК_АВР=АВР_Д/АВР_П,

 

где Д – донор,
П – пациент.

 

Протромбиновый индекс (ПТИ) вычислялся по формуле:

 

ПТИ (%) = ПВД/ПВП× 100%,

 

где ПВ – протромбиновое время.

 

Для качественного определения в плазме крови растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) применялся РФМК-тест (Момот А. П. и соавт., 1996), активированное парциальное тромбопластиновое вре­мя (АПТВ) определяли согласно инструкции «Технологии-стандарт» (Россия). С помощью этого исследования определялось время сверты­вания крови в условиях стандартизованной контактной (каолином) и фосфолипидной (кефалином) активации процесса в присутствии ионов кальция.

Индекс АПТВ вычислялся с помощью формулы:

 

Индекс АПТВ = АПТВП/АПТВД

 

Активность антитромбина III (АТ III) определяли согласно инструк­ции «Технологии-стандарт» (Россия).

Протромбиновое отношение (ПО) вычисляли по формуле:

ПО = (Протромбиновое время больного) / (Протромбиновое время плазмы)

В последующем рассчитывали международное нормализованное от­ношение (МНО), исходя из ПО и международного индекса чувствитель­ности (МИЧ) (Гаранина Е.Н и соавт., 1994). D-димер в плазме крови исследовался качественно (Тиц Н., 1997).

Результаты исследования

Сосудисто-тромбоцитарное звено гемостаза

Необходимо обратить внимание на то, что гиперагрегация тром­боцитов, индуцированная АДФ, позволяет судить о повышении пер­вичной агрегации кровяных пластинок, которая является обратимой (Репина М. А. и соавт., 1998).

В механизме агрегации тромбоцитов исключительно важную роль играют циклические эндоперекиси и тромбоксаны. Под влиянием ин­дукторов агрегации коллагена и тромбина активируется фосфолипаза А2 мембраны тромбоцитов, что обеспечивает активацию перекисного окисления липидов (ПОЛ), приводя к расщеплению фосфолипидов мембраны (Амелин А. В. с соавт., 2000). Интересен тот факт, что в плазме крови доноров, в которую добавляли реамберин, отмечалось достовер­ное увеличение времени достижения максимальной амплитуды агрегатограммы как после инкубации 10 минут, так и после инкубации 60 ми­нут, что свидетельствует о возможном снижении скорости склеивания тромбоцитов между собой (Багатырова К. М., 1993).

Последнее обстоятельство носит позитивный характер и может рас­цениваться как прогностически благоприятный критерий для реко­мендаций по применению препарата у пациентов с тромботическими поражениями артерий организма. Этот параметр в плазме крови доно­ров контрольной группы после добавления физиологического раствора при инкубации 10 и 60 минут практически не отличался от его значения в плазме крови доноров без добавления физиологического раствора.

Плазменно-коагуляционное звено гемостаза

Условно процесс активации свертывания крови подразделяют на три стадии: образование протромбиназы, образование тромбина и образо­вание нерастворимого фибрина.

Активация фактора Х по внутреннему пути. В плазме крови доно­ров под влиянием реамберина регистрировалось снижение индекса АВР без тромбоцитов, АВР с тромбоцитами и укорочение АПТВ по сравне­нию с этими показателями в плазме крови доноров в контрольной серии опытов. Изменения в этих группах не выходили за рамки нормы.

Активация фактора Х по внешнему пути. В плазме крови доноров с реамберином выявлено удлинение протромбинового времени по срав­нению с этими показателями в плазме крови доноров в контрольной серии опытов. Изменения в этих группах не выходили за рамки нормы.

Образование фибрина. При проведении исследования было заре­гистрировано достоверное увеличение тромбинового времени в плазме крови доноров после добавления реамберина по сравнению с этими показателями в плазме крови доноров в контрольной серии опытов.

Отмечено достоверное уменьшение концентрации фибриногена в плазме крови после использования реамберина по сравнению с уровнем этого показателя в плазме крови контрольной серии опытов. Изменения в этих группах не выходили за рамки нормы. В свою очередь, необхо­димо отметить, что уровень РФМК в плазме крови у доноров под вли­янием реамберина несколько ниже, чем в контроле. Изменения в этих группах выходили за рамки нормы.

Физиологические антикоагулянты. Активность одного из естест­венных антикоагулянтов – антитромбина III, снижалась под влиянием реамберина, по сравнению с контрольной группой.

При проведении статистической обработки остальных данных плазменно-коагуляционного звена гемостаза с использованием критерия Стьюдента отклонений от показателей нормы в основной и в контроль­ной серии опытов не получено.

Обсуждение полученных результатов

Под влиянием реамберина в плазме крови доноров in vitro наблюда­ется тенденция ускорения активации фактора X по внутреннему пути и торможение активации фактора X по внешнему пути.

Достоверное удлинение тромбинового времени под влиянием реам­берина в плазме крови доноров in vitro при нормальной концентрации антитромбина III, отсутствии D-димеров позволяет говорить о наличии ранних продуктов деградации фибриногена (X), обладающих антитромбиновой активностью.

Достоверное снижение концентрации фибриногена в сочетании с удлинением тромбинового времени под влиянием реамберина в плазме крови доноров in vitro, по-видимому, можно объяснить фибриногенолизом.

Заключение

Добавление раствора реамберина в плазму крови доноров in vitro приводит к:

1. антиагрегантному эффекту;

2. фибриногенолизу.